二元调控系统

详细内容

1. GAL4/UAS系统

果蝇GAL4/UAS系统是遗传学研究中广泛应用的基因表达调控系统。它起源于酵母半乳糖代谢调控元件，经科学家多年的建立与优化，已广泛应用于果蝇等多种模式生物。

1.1 系统组成

• UAS（Upstream Activating Sequence，上游激活序列）：GAL4转录因子特异性识别和结合的DNA序列。GAL4结合到UAS上，即可驱动其下游基因的表达。
• GAL4：酵母半乳糖代谢（galactose metabolism）相关的转录调控因子，得名于酵母GAL4基因座。它包含两个主要功能结构域：DNA结合结构域（Binding Domain, BD）和转录激活结构域（Activation Domain, AD）。BD负责特异性识别并结合UAS；AD并不与靶基因启动子直接结合，而是招募转录机器（如中介体复合物等），从而激活UAS下游基因的转录。

1.2 工作原理

在GAL4/UAS系统中，GAL4和UAS分别存在于两个不同的转基因品系中：

• GAL4驱动品系：含有GAL4转录激活因子，但不含效应基因。GAL4的表达受特定启动子或增强子控制，可在特定的组织或时间表达。
• UAS-效应基因品系：将需要研究的效应基因（用于过表达、RNA干扰等）插入UAS下游，构建成UAS-效应基因转基因品系。由于该品系中没有GAL4，效应基因处于沉默状态。

将GAL4驱动品系与UAS-效应基因品系杂交，子代同时携带GAL4和UAS-效应基因。此时，GAL4在特定组织或时间表达，其BD与UAS结合，AD招募转录机器，从而驱动效应基因在相同的时空模式下表达（图1.1）。

图1 GAL4/UAS系统工作原理

1.3 实验流程（转基因品系构建）

以attP-PhiC31定点整合系统构建UAS转基因果蝇为例，标准流程如下（图1.2a、b）：

1. 注射样品制备（1~4周）：采用无缝克隆连接构建Donor载体，载体包含attB位点、UAS和miniWhite标记（marker）；目的片段可来自质粒亚克隆、cDNA克隆或基因合成等方式；Donor质粒进行去内毒素提取。
2. 显微注射（约2周）：将Donor质粒注射入attP果蝇品系（携带PhiC31整合酶）的胚胎，注射胚胎数200~300个。
3. 杂交和筛选（约2周）：P0果蝇与平衡子品系杂交，根据miniWhite标记（红眼）筛选F1阳性果蝇。
4. 分子鉴定（约2周）：鉴定插入的目的序列及基因组插入位置。
5. 构建稳定遗传品系（8~10周）：
   • 普通过表达品系：F2果蝇与GAL4驱动品系杂交，构建UAS+GAL4稳定/纯合品系（图1.2b）；
   • 全身温控过表达品系：F1阳性果蝇先与双染色体平衡子杂交，构建UAS稳定/纯合品系；F2果蝇再与Sp/CyO;Tubp-GAL4,Tubp-GAL80ts驱动品系杂交，构建2、3号染色体双平衡的UAS;GAL4,GAL80ts稳定/纯合品系（图1.2a）。

两种流程合计周期均约13~18周。

温控原理：GAL80是GAL4的抑制蛋白，通过与GAL4的AD结合而阻止转录激活。GAL80ts是GAL80的温度敏感突变体：在低温（如18 ℃）下与GAL4结合、抑制表达；在较高温度（如29 ℃）下失去抑制作用、允许表达；中间温度可获得梯度水平的表达，从而实现时间可控的基因表达（图1.2c）。

图2 attP-PhiC31定点插入（GAL4-UAS全身温控过表达果蝇品系构建）

图3 attP-PhiC31定点插入（GAL4-UAS过表达果蝇品系构建）

图4 UAS+GAL4,GAL80ts温控表达原理示意图

2. LexA/LexAop系统

LexAop（LexA operator，LexA操纵基因）是受LexA蛋白调控的操纵基因DNA序列。该系统通常以融合蛋白的形式实现：

• 非GAL80抑制型：LexA-VP16融合蛋白中，LexA的DNA结合结构域与LexAop结合，VP16（来源于疱疹病毒的转录激活结构域）招募转录机器，激活LexAop下游目的基因的转录。由于VP16不能被GAL80抑制，该系统又称"非GAL80抑制的LexA/LexAop系统"（图2.1左）。
• GAL80抑制型：类似地，LexA-GAL4激活结构域融合蛋白（LexA-GAD）中，LexA与LexAop结合、GAD激活后续序列的转录，同样可以激活目的基因。但当该系统中引入GAL80时，GAL80与GAD结合并抑制其活性，从而抑制LexAop下游基因的转录，故又称"GAL80抑制的LexA/LexAop系统"（图2.1右）。

优点：与GAL4/UAS系统相互独立、互不影响；LexA-VP16版本不受GAL80抑制。

缺点：表达效率低于GAL4/UAS和Q系统；无LexA时，LexAop存在一定水平的本底转录（渗漏表达）。

图5 LexA/LexAop系统

3. Q系统

Q系统与LexA/LexAop系统的原理类似，与GAL4/UAS系统互不干扰。该系统由三大元件组成：转录激活因子QF（来源于链孢霉Neurospora的qa-1F基因）、效应元件QUAS以及QF的抑制子QS（来源于qa-1S基因）。在Q系统中，QUAS为一段5个拷贝（每个拷贝长度16 bp）的串联序列，与下游的目的基因相连。QF为转录激活因子，表达后与QUAS结合，激活目的基因的表达；QS为QF的抑制子，QS表达时抑制QF与QUAS的结合，从而关闭目的基因的表达（图3.1）。加入奎尼酸（quinic acid）可与QS结合、解除其对QF的抑制作用，且该解除作用具有剂量依赖性，因此可实现时间可控的基因表达。

与GAL4/UAS系统相比，Q系统能够更加精确地标记一个或一小群细胞；但其限制在于特异性表达的QF品系较少，且构建果蝇品系需要引入的基因较多、操作复杂，因而应用范围较GAL4/UAS系统更为有限，目前主要应用于以线虫和果蝇为模式动物的研究。

优点：与GAL4/UAS系统相互独立、互不影响；可标记和操纵单个细胞或一小群细胞；无QF时，QUAS的本底转录水平低。

缺点：特异性的QF品系果蝇少；构建品系需要引入8个基因，操作复杂。

图6 Q系统工作原理

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