CRISPR Indel 移码突变

单 gRNA 引导 Cas9 切割基因组靶位点，由 NHEJ 修复引入小片段插入缺失，造成编码区移码突变从而破坏基因功能。

原理 · 流程 · 优势 · 适用 · 风险

技术原理

Cas9 核酸内切酶在 gRNA 引导下识别并切割基因组靶位点，产生 DNA 双链断裂。细胞通过非同源末端连接（NHEJ）修复该断裂时，可在断裂位点引入小片段插入或缺失（Indel）。当 Indel 长度非 3 的倍数时，导致下游编码区移码突变，使蛋白翻译提前终止或产生截短蛋白，从而破坏目标基因功能。

工作流程

项目评估与方案设计 → Target 测序 → 注射样品制备 → 显微注射 → 杂交鉴定 → 稳定系/纯合系构建

核心优势

操作成熟、周期短：标准化单 gRNA 设计流程，平均交付周期 13~15 周
设计简单：单 gRNA 即可引导 Cas9，适用于大多数蛋白编码基因
递送方式灵活：支持胚胎注射、细胞转染等多种递送路径，适配不同实验设计
多等位基因筛选：可针对同一基因设计多个 gRNA，便于筛选不同移码等位基因进行表型比较

典型适用

基因功能缺失或功能初筛靶基因周边序列密集多独立等位基因表型验证关键功能区域破坏

风险与限制

Indel 结果具有不确定性：可能获得移码、框内缺失、插入或复杂等位基因，必须通过测序筛选，不能仅凭编辑阳性判断敲除成功
可能存在残余基因功能：移码后仍可能发生异常剪接、替代翻译或残余蛋白表达。重要项目建议结合 RNA、蛋白或遗传回补实验验证
脱靶和非预期在靶改变：建议在项目设计阶段评估潜在脱靶位点，必要时通过全基因组测序或脱靶位点深度测序验证

技术原理

两大核心要素

Cas9 核酸内切酶：在 gRNA 引导下识别基因组 PAM 上游序列，在特定位点产生 DNA 双链断裂（DSB）。
gRNA 引导序列：约 20 nt 的特异性序列决定靶位点识别，结合 Cas9 后介导精准切割。

细胞主要通过 NHEJ 修复 DSB，在修复过程中引入小片段插入或缺失；当 Indel 长度非 3 的倍数时，可造成编码区移码突变，使蛋白翻译提前终止或产生截短蛋白，从而破坏目标基因功能。

CRISPR Indel 移码突变原理示意：Cas9 + gRNA 切割基因组靶位点，NHEJ 修复引入 Indel 导致移码突变

实验流程

CRISPR indel（one target）

实验步骤	内容	周期（周）
Target 测序	1. 方法：PCR 测序 2. 目的：确定注射果蝇品系的靶序列，确保 gRNA 序列正确并进行有效切割	2
gRNA 和 cas9-mRNA 合成制备	1. gRNA 设计：一个靶位点设计两个 gRNA 2. gRNA 合成：T7 体外转录合成 3. cas9-mRNA 合成：优化的 cas9-DNA 质粒为模板，体外转录合成 cas9-mRNA	3
显微注射	1. 注射品系：w[1118]（或者指定品系） 2. 注射样品：gRNA + cas9-mRNA 3. 注射胚胎数量：300-400 个	4
杂交鉴定和构建稳定品系	1. P0 果蝇与平衡子杂交，并进行 Indel 测序鉴定 2. 阳性 P0 的子代 F1 果蝇与平衡子杂交，并进行 Indel 测序鉴定 3. 阳性 F1 的子代 F2 果蝇与平衡子杂交，并进行 Indel 测序鉴定 4. 阳性 F2 的子代 F3 果蝇自交构建稳定品系 5. F3 的子代 F4 果蝇自交构建纯合品系，并进行 Indel 测序鉴定	5
合计		13~15