attP-phiC31 定点插入
phiC31 整合酶介导 attB / attP 位点特异性重组，将外源基因精准插入预设 attP 位点；插入位置预先确定，跨品系结果可重复。
原理 · 流程 · 优势 · 品系 · 适用 · 风险
技术原理
phiC31 整合酶识别并介导 attP 与 attB 之间的特异性重组：attP 位点预先整合在果蝇基因组中作为接受位点（landing site），attB 位点位于含目的基因的供体载体上。重组后供体载体整合至 attP 位置，原 attP / attB 转化为杂合位点 attL / attR，在常规条件下不再作为有效底物，因此插入结构可稳定遗传。
工作流程
注射样品制备
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显微注射
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杂交和筛选
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分子鉴定
→
构建稳定品系
核心优势
- 插入位置明确：整合至预设 attP 位点，插入染色体和基因组位置已知
- 平行可比性强：不同构建体插入同一 attP 位点，减少随机位置造成的表达差异
- 稳定遗传：重组后 attL / attR 不再作为有效底物，可稳定遗传
- 位点选择灵活：可按染色体、杂交设计、表达需求选择不同 attP
- 兼容多种表达系统：GAL4/UAS、LexA/LexAop、QF/QUAS、Split-GAL4 等
品系
| attP 位点 | 染色体 | 染色体臂及细胞学位置 |
|---|---|---|
| attP40 | II | 2L, 25C6 |
| attP5 | II | 2R, 50F1 |
| attP2 | III | 3L, 68A4 |
| VK00005 | III | 3L, 75A10 |
典型适用
风险与限制
- 不能完全消除位置效应：attP 周围的染色质环境（增强子、沉默染色质）仍可能影响转基因表达，不同 attP 位点之间存在表达差异。
- 部分 landing site 影响邻近基因：插入位点附近的内源基因功能可能被破坏或调控异常，需通过分子鉴定确认插入位置并评估安全位点。
- 纯合品系并非所有项目都可获得：部分 attP 位点纯合致死或显著影响育性，需要配套平衡子长期维持，必要时只能以杂合或平衡形式交付。
技术原理
实验流程
| 实验步骤 | 内容 | 周期（周） |
|---|---|---|
| 注射样品制备 | 1. Donor 载体构建（无缝克隆连接） 载体：包含 attB 位点 + marker 片段：包括质粒亚克隆、cDNA 克隆、基因合成等方式 2. Donor 质粒去内毒素提取 |
1~4 |
| 显微注射 | 1. 注射品系：attP 果蝇品系（PhiC31 内源表达） 2 号染色体：attP40、attP5 3 号染色体：attP2、VK00005 2. 注射样品：donor 质粒 3. 注射胚胎数量：200-300 个 |
2 |
| 杂交和筛选 | 1. P0 果蝇与平衡子杂交 2. 筛选 F1 阳性果蝇（红眼） |
2 |
| 分子鉴定 | 1. 插入目的序列鉴定 2. 插入基因组位置鉴定 |
0 |
| 构建稳定遗传品系 | 1. F1 阳性果蝇自交 2. F2 果蝇与平衡子杂交 3. 平衡纯合筛选和测序鉴定 4. 自交构建稳定品系 |
4~6 |
| 合计 | 9~14 |