CRISPR Point Mutation 点突变

通过同义突变 donor 在目标氨基酸两侧引入标记，HDR 修复精准实现氨基酸位点替换。

原理 · 流程 · 优势 · 适用 · 风险

技术原理

根据目标转录本和突变位点，设计邻近且脱靶风险较低的 gRNA。Cas9 在目标区域产生 DNA 双链断裂，细胞以含目标突变和同源臂的 donor DNA 为模板，通过同源定向修复（HDR）将指定序列写入基因组。若目标突变本身不能阻止 Cas9 再次识别，可在 PAM 或 gRNA seed 区加入最少量、经评估的同义阻断突变，以降低修复后再次切割的风险，并辅助分子筛选。

工作流程

项目评估与方案设计 → Target 测序 → 注射样品制备 → 显微注射 → 杂交鉴定 → 稳定系/纯合系构建

核心优势

单氨基酸精准替换：可定向改变单个氨基酸残基，不影响上下游序列与蛋白整体结构
原版背景保真：仅替换目标位点，保留基因天然调控元件与表达模式，避免整段删除或标签融合的副作用
灵活设计阻断突变：可在 PAM 或 gRNA seed 区加入最少量同义阻断突变，显著降低修复后再次切割风险
分子筛选便利：同义阻断突变天然引入限制性酶切位点或 PCR 标识，便于筛选与建系鉴定

典型适用

疾病位点建模关键氨基酸功能验证蛋白功能域定点改造进化保守位点功能研究

风险与限制

HDR 效率较低：单氨基酸替换依赖 HR 而非 NHEJ，整体敲入效率显著低于 Indel/KO，需要更多胚胎注射量和精细筛选
同义阻断突变引入风险：在 PAM 或 gRNA seed 区加入的同义阻断突变虽不改变氨基酸，仍需评估对 mRNA 折叠、剪接或翻译效率的潜在影响
候选位点受限：需在 gRNA 切割位点附近存在合适的同义突变空间，且目标氨基酸位于 PAM 上下游合理距离内
验证依赖 Sanger 测序：点突变改造需通过 Sanger 测序确认替换边界和同义突变引入准确性，周期与成本较 Indel 更高

技术原理

HDR 介导的精准氨基酸替换

针对目标氨基酸位点设计 gRNA 并构建含同义突变 + 同源臂的 donor DNA，通过 HDR 将目标氨基酸位点精准替换为目标残基，同时通过同义突变在两侧引入辅助筛选标记。

若目标突变本身不能阻止 Cas9 再次识别，可在 PAM 或 gRNA seed 区加入最少量、经评估的同义阻断突变，以降低修复后再次切割的风险，并辅助分子筛选与建系。

CRISPR Point Mutation 点突变原理示意：通过同义突变 donor 在目标氨基酸两侧引入标记，HDR 修复精准替换氨基酸位点

实验流程

CRISPR KI（point mutation）

实验步骤	内容	周期（周）
target 测序	1. 方法：PCR 测序 2. 目的：确定注射果蝇品系的靶序列，确保 gRNA 序列正确并进行有效切割	1
gRNA 和 cas9-mRNA 合成制备	1. gRNA 设计：一个靶位点设计两个 gRNA 2. gRNA 合成：T7 体外转录合成 3. cas9-mRNA 合成：优化的 cas9-DNA 质粒为模板，体外转录合成 cas9-mRNA	0
donor 质粒载体构建	1. arm 载体构建（无缝克隆连接）载体：Amp 抗性常规载体片段：注射果蝇基因组 DNA 中克隆 5' + 3' 同源臂 2. Donor 载体构建（无缝克隆连接）载体：arm 载体 PCR 线性化，并引入目的点突变和 gRNA 识别位置点突变 3. Donor 质粒去内毒素提取	3~4
显微注射	1. 注射品系：w1118（或者指定品系） 2. 注射样品：gRNA + cas9-mRNA + donor 3. 注射胚胎数量：400-500 个	2
杂交鉴定和构建稳定品系	1. P0 果蝇与平衡子杂交，并进行点突变和基因组插入位置 PCR 鉴定 2. 阳性 P0 的子代 F1 果蝇与平衡子杂交，并进行点突变和基因组插入位置 PCR 和测序鉴定 3. 阳性 F1 的子代 F2 果蝇与平衡子杂交，并进行点突变和基因组插入位置 PCR 鉴定 4. 阳性 F2 的子代 F3 果蝇自交构建稳定品系 5. F3 的子代 F4 果蝇自交构建纯合品系，并进行点突变测序鉴定	8~10
合计		13~16