CRISPR Knock-in (Tag) 标签插入
通过 CRISPR 和 donor 质粒的同源重组修复，在目标基因内源位点精准插入 GFP / FLAG / HA / Myc / V5 等标签或其它外源基因序列；支持"有筛选标记"和"直接无筛选标记"两种技术方案。
原理 · 流程 · 方案 · 优势 · 适用 · 风险
技术原理
通过 CRISPR 和 donor 质粒（同源臂 + 插入序列）的共同作用，实现对靶点进行切割的同时，由细胞 HR（同源重组）修复方式在目标基因内源位点精准插入 GFP、FLAG、HA、Myc、V5 等标签或其它外源基因序列。本服务支持"有筛选标记"和"直接无筛选标记"两种技术方案：前者使用 RFP 等标记便于阳性筛选但需后续移除，后者通过分子鉴定获得精确无多余序列的插入。
工作流程
项目评估与方案设计
→
Target 测序
→
注射样品制备
→
显微注射
→
杂交鉴定
→
marker 去除与复核（按需）
→
稳定系/纯合系构建
技术方案对比
| 项目 | 无 marker | 有 marker |
|---|---|---|
| 获得阳性方式 | 分子鉴定 | 表型筛选（RFP） |
| 效率 | 略高 | 略低 |
| 筛选阳性通量 | 大部分 F1 代 | 全部 F1 代 |
| 成功率 | 较高 | |
| 编辑后序列 | 精确 无多余序列 | 移除后残留 34bp 的 loxP |
| 周期 | 相对短 | 较长，需要 marker 移除 |
| 价格 | 相对高，分子鉴定成本高 | 相对低，阳性筛选方便 |
| 试用范围 | 广泛 | 仅针对 C 端插入 |
核心优势
- 精准插入：通过 HR 同源重组将标签精确插入目标基因内源位点，保留天然表达调控
- 多标签兼容：支持 GFP / FLAG / HA / Myc / V5 等常用标签，适配不同检测需求
- 双方案可选：提供有 marker 与无 marker 两套方案，平衡筛选便利性与最终序列精度
- 适用性广：可用于蛋白定位、互作、表达追踪等多种功能研究场景
典型适用
风险与限制
- 标签功能干扰：Tag 或 linker 可能影响蛋白折叠、稳定性、定位、酶活性或蛋白互作。N/C 端选择需结合功能域、信号肽和末端基序评估；已有研究报道某些 C 端标签可造成果蝇蛋白功能缺失
- marker 残留影响：筛选标记及去除后残留的重组位点可能干扰邻近基因表达、RNA 加工或后续遗传操作
- 表达检测限制：内源低表达蛋白即使正确插入荧光 Tag，也可能因信号较弱而难以直接成像
- 品系构建风险：对必需基因进行标签插入后，若纯合个体不存活或不育，可能只能建立杂合或平衡品系
技术原理
通过 CRISPR 在目标基因特定位点产生双链断裂，配合携带同源臂和插入序列的 donor 质粒，由细胞 HDR 修复机制实现标签的精准插入。下方分别展示有筛选标记和无筛选标记两种方案的工作原理。
有筛选标记方案
无筛选标记方案
实验流程
| 实验步骤 | 内容 | 周期（周） |
|---|---|---|
| target 测序 | 1. 方法：PCR 测序 2. 目的：确定注射果蝇品系的靶序列，确保 gRNA 序列正确并进行有效切割 |
1 |
| gRNA 和 cas9-mRNA 合成制备 | 1. gRNA 设计：一个靶位点设计两个 gRNA 2. gRNA 合成：T7 体外转录合成 3. cas9-mRNA 合成：优化的 cas9-DNA 质粒为模板，体外转录合成 cas9-mRNA |
0 |
| donor 质粒载体构建 | 1. arm 载体构建（无缝克隆连接） 载体：Amp 抗性常规载体 片段：注射果蝇基因组 DNA 中克隆 5' + 3' 同源臂 2. Donor 载体构建（无缝克隆连接） 载体：arm 载体 PCR 线性化，并在 gRNA 识别位置引入点突变 片段：插入序列 + loxP-3P3-RFP-loxP marker（LRL） 3. Donor 质粒去内毒素提取 |
3~4 |
| 显微注射 | 1. 注射品系：w1118（或者指定品系） 2. 注射样品：gRNA + cas9-mRNA + donor 3. 注射胚胎数量：400-500 个 |
2 |
| 杂交和筛选 | 1. P0 果蝇与平衡子杂交 2. 筛选 F1 阳性果蝇（3P3-RFP） |
2 |
| 分子鉴定 | 插入序列和基因组插入位置 PCR 和测序鉴定 | 0 |
| marker 移除和构建稳定品系 | 1. F1 阳性果蝇杂交平衡子 2. 构建 RFP 稳定/纯合品系 3. F2 果蝇与 CRE 内源表达品系杂交 4. 子代 F3 挑选无 RFP 果蝇杂交平衡子，并进行 PCR 和测序鉴定确保 RFP 移除 5. 构建 marker 移除的稳定/纯合品系 |
10~12 |
| 合计 | 18~21 |
| 实验步骤 | 内容 | 周期（周） |
|---|---|---|
| target 测序 | 1. 方法：PCR 测序 2. 目的：确定注射果蝇品系的靶序列，确保 gRNA 序列正确并进行有效切割 |
1 |
| gRNA 和 cas9-mRNA 合成制备 | 1. gRNA 设计：一个靶位点设计两个 gRNA 2. gRNA 合成：T7 体外转录合成 3. cas9-mRNA 合成：优化的 cas9-DNA 质粒为模板，体外转录合成 cas9-mRNA |
0 |
| donor 质粒载体构建 | 1. arm 载体构建（无缝克隆连接） 载体：Amp 抗性常规载体 片段：注射果蝇基因组 DNA 中克隆 5' + 3' 同源臂 2. Donor 载体构建（无缝克隆连接） 载体：arm 载体 PCR 线性化，并在 gRNA 识别位置引入点突变 片段：插入序列 3. Donor 质粒去内毒素提取 |
3~4 |
| 显微注射 | 1. 注射品系：w1118（或者指定品系） 2. 注射样品：gRNA + cas9-mRNA + donor 3. 注射胚胎数量：400-500 个 |
2 |
| 杂交鉴定和构建稳定品系 | 1. P0 果蝇与平衡子杂交，并进行插入序列和基因组插入位置 PCR 鉴定 2. 阳性 P0 的子代 F1 果蝇与平衡子杂交，并进行插入序列和基因组插入位置 PCR 和测序鉴定 3. 阳性 F1 的子代 F2 果蝇与平衡子杂交，并进行插入序列和基因组插入位置 PCR 鉴定 4. 阳性 F2 的子代 F3 果蝇自交构建稳定/纯合品系 |
8~10 |
| 合计 | 14~17 |