CRISPR KO 大片段敲除
双 gRNA 引导 Cas9 在两个靶点切割，NHEJ 修复连接后删除中间整段序列；已验证 20kb+ 大片段敲除经验。
原理 · 流程 · 优势 · 适用 · 风险
技术原理
针对目标区域两端分别设计 gRNA，引导 Cas9 蛋白在两个靶位点同时产生 DNA 双链断裂（DSB）。细胞通过非同源末端连接（NHEJ）修复两个断裂末端时，会删除两个靶点之间的整段基因组序列。该方案可一次性删除目标基因的核心功能域、整个编码区甚至整段基因簇。
工作流程
项目评估与方案设计
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Target 测序
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注射样品制备
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显微注射
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杂交鉴定
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稳定系/纯合系构建
核心优势
- 可敲除 20kb 以上基因组大片段，一次性删除基因核心功能域、整个编码区或整段基因簇
- 优化设计方案，最小化对邻近基因的影响
- 特异性高，易于通过跨靶点 PCR 等分子手段鉴定大片段缺失
- 适合基因簇或整段调控区域删除等单点编辑难以实现的场景
典型适用
风险与限制
- 可能产生非目标修复结果：NHEJ 修复不可控，两个 DSB 连接处可能出现非预期插入或缺失，必须通过跨靶点 PCR + Sanger 测序确认断裂点
- 存在潜在脱靶风险：建议项目设计阶段评估两个 gRNA 的潜在脱靶位点，必要时通过脱靶位点深度测序验证
- 可能影响邻近功能元件：大片段删除可能波及上下游关键调控元件或邻近基因，建议方案设计时检查删除区间内的已知功能元件
- 可能出现纯合致死或不育：核心基因完全缺失往往导致纯合个体致死或不育，需通过平衡子或杂合品系维持
技术原理
两个 gRNA + Cas9 双切
针对目标片段两端分别设计 gRNA，引导 Cas9 在两个靶位点同时产生 DNA 双链断裂（DSB），实现同一染色体上两个相距一定距离的位点同步切割。
细胞通过 NHEJ 修复连接两个断裂末端时，会删除两个靶点之间的整段序列，从而实现大片段敲除。本服务已验证 20kb+ 大片段缺失经验，可用于基因簇或整段调控区域的一站式删除。
实验流程
| 实验步骤 | 内容 | 周期（周） |
|---|---|---|
| target 测序 | 1. 方法：PCR 测序 2. 目的：确定注射果蝇品系的靶序列，确保 gRNA 序列正确并进行有效切割 |
1 |
| gRNA 和 cas9-mRNA 合成制备 | 1. gRNA 设计：两个靶位点各设计两个 gRNA 2. gRNA 合成：T7 体外转录合成 3. cas9-mRNA 合成：优化的 cas9-DNA 质粒为模板，体外转录合成 cas9-mRNA |
2 |
| 显微注射 | 1. 注射品系：w1118（或者指定品系） 2. 注射样品：gRNA + cas9-mRNA 3. 注射胚胎数量：300-400 个 |
2 |
| 杂交鉴定和构建稳定品系 | 1. P0 果蝇与平衡子杂交，并进行 KO PCR 鉴定 2. 阳性 P0 的子代 F1 果蝇与平衡子杂交，并进行 KO PCR 和测序鉴定 3. 阳性 F1 的子代 F2 果蝇与平衡子杂交，并进行 KO PCR 鉴定 4. 阳性 F2 的子代 F3 果蝇自交构建稳定/纯合品系 |
8~10 |
| 合计 | 13~15 |