CRISPR Knock-in (Replacement) 基因替换
通过 HDR 修复将内源基因替换为外源同源基因；特别适合内源序列与替换序列相似度较低的情况。
原理 · 流程 · 优势 · 适用 · 风险
技术原理
设计 gRNA 靶向目标内源基因编码区，构建含长同源臂（5' / 3' HA 各 1-2 kb）+ 外源同源基因序列（如人类、小鼠、斑马鱼等物种的同源基因）的 donor 质粒。Cas9 切割后细胞通过 HDR 修复，将内源基因整段替换为外源插入序列。该方案特别适合内源序列与替换序列相似度较低的情况，避免同源臂识别冲突。
工作流程
项目评估与方案设计
→
Target 测序
→
注射样品制备
→
显微注射
→
杂交鉴定
→
稳定系/纯合系构建
核心优势
- 整段基因替换：可一次性替换内源基因整段编码区，避免 KI-tag 的标签融合局限
- 跨物种同源基因替换：支持人、小鼠、斑马鱼等物种的同源基因外源片段替换内源基因
- 长同源臂保证 HR 效率：5'/3' HA 各 1-2 kb 的长同源臂显著提升同源重组成功率
- 不受序列相似度限制：特别适合内源与替换序列相似度低、不易使用常规 KI-tag 的场景
典型适用
风险与限制
- HR 效率较低：基因替换依赖 HR 而非 NHEJ，整体敲入效率显著低于 KI-tag，需要更多胚胎注射量和精细筛选
- 长同源臂构建复杂：5'/3' HA 各 1-2 kb 的 donor 质粒构建周期较长（3-4 周），对克隆和测序验证要求高
- 替换边界不精确：HR 边界处可能出现小片段插入/缺失或残留序列，需 Sanger 测序确认断点
- 内源调控丢失：整段替换后可能丢失原基因的远端调控元件或非翻译区，需评估对表达水平的影响
技术原理
长同源臂 donor + HR 介导
针对目标内源基因编码区设计 gRNA，构建含 5'/3' 长同源臂（各 1-2 kb）+ 外源同源基因序列的 donor 质粒，通过 HDR 介导的精准替换实现内源基因整段置换。
该方案特别适合内源序列与替换序列相似度较低、常规 Knock-in Tag 难以实施的场景；通过长同源臂保证 HDR 效率，避免同源臂识别冲突。
实验流程
| 实验步骤 | 内容 | 周期（周） |
|---|---|---|
| target 测序 | 1. 方法：PCR 测序 2. 目的：确定注射果蝇品系的靶序列，确保 gRNA 序列正确并进行有效切割 |
1 |
| gRNA 和 cas9-mRNA 合成制备 | 1. gRNA 设计：两个靶位点各设计两个 gRNA 2. gRNA 合成：T7 体外转录合成 3. cas9-mRNA 合成：优化的 cas9-DNA 质粒为模板，体外转录合成 cas9-mRNA |
0 |
| donor 质粒载体构建 | 1. arm 载体构建（无缝克隆连接） 载体：Amp 抗性常规载体 片段：注射果蝇基因组 DNA 中克隆 5' + 3' 同源臂 2. Donor 载体构建（无缝克隆连接） 载体：arm 载体 PCR 线性化，并在 gRNA 识别位置引入点突变 片段：插入序列 + loxP-3P3-RFP-loxP marker（LRL） 3. Donor 质粒去内毒素提取 |
3~4 |
| 显微注射 | 1. 注射品系：w1118（或者指定品系） 2. 注射样品：gRNA + cas9-mRNA + donor 3. 注射胚胎数量：500-600 个 |
2 |
| 杂交和筛选 | 1. P0 果蝇与平衡子杂交 2. 筛选 F1 阳性果蝇（3P3-RFP） |
2 |
| 分子鉴定 | 插入序列和基因组插入位置 PCR 和测序鉴定 | 0 |
| marker 移除和构建稳定品系 | 1. F1 阳性果蝇杂交平衡子 2. 构建 RFP 稳定/纯合品系 3. F2 果蝇与 CRE 内源表达品系杂交 4. 子代 F3 挑选无 RFP 果蝇杂交平衡子，并进行 PCR 和测序鉴定确保 RFP 移除 5. 构建 marker 移除的稳定/纯合品系 |
10~12 |
| 合计 | 18~21 |
| 实验步骤 | 内容 | 周期（周） |
|---|---|---|
| target 测序 | 1. 方法：PCR 测序 2. 目的：确定注射果蝇品系的靶序列，确保 gRNA 序列正确并进行有效切割 |
1 |
| gRNA 和 cas9-mRNA 合成制备 | 1. gRNA 设计：两个靶位点各设计两个 gRNA 2. gRNA 合成：T7 体外转录合成 3. cas9-mRNA 合成：优化的 cas9-DNA 质粒为模板，体外转录合成 cas9-mRNA |
0 |
| donor 质粒载体构建 | 1. arm 载体构建（无缝克隆连接） 载体：Amp 抗性常规载体 片段：注射果蝇基因组 DNA 中克隆 5' + 3' 同源臂 2. Donor 载体构建（无缝克隆连接） 载体：arm 载体 PCR 线性化，并在 gRNA 识别位置引入点突变 片段：插入序列 3. Donor 质粒去内毒素提取 |
3~4 |
| 显微注射 | 1. 注射品系：w1118（或者指定品系） 2. 注射样品：gRNA + cas9-mRNA + donor 3. 注射胚胎数量：500-600 个 |
2 |
| 杂交鉴定和构建稳定品系 | 1. P0 果蝇与平衡子杂交，并进行插入序列和基因组插入位置 PCR 鉴定 2. 阳性 P0 的子代 F1 果蝇与平衡子杂交，并进行插入序列和基因组插入位置 PCR 和测序鉴定 3. 阳性 F1 的子代 F2 果蝇与平衡子杂交，并进行插入序列和基因组插入位置 PCR 鉴定 4. 阳性 F2 的子代 F3 果蝇自交构建稳定/纯合品系 |
8~10 |
| 合计 | 14~17 |