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1. 果蝇生活史
1.1 生活史
果蝇（黑腹果蝇 Drosophila melanogaster）的生活史包括卵、幼虫、蛹、成虫四个连续的发育阶段（图1.1）。在25 ℃条件下，从产卵到成虫羽化约需9~10天。
图1 果蝇生活史
卵：白色，长椭圆形，长约0.5 mm。卵背面前端伸出一对触丝（背突），使卵附着于柔软的食物表面而不致深陷到培养基中，同时有助于卵的呼吸。
幼虫：在25 ℃下，以产卵时间为起点，约24 h孵化为1龄幼虫，约48 h蜕皮进入2龄，约72 h进入3龄；幼虫经两次蜕皮共三个龄期，3龄末体长可达4~5 mm。在解剖镜下观察，可见虫体一端稍尖为头部，头部有一黑点即口器；稍后有一对半透明的唾腺，每条唾腺前有一条唾腺管向前延伸，然后会合成一条导管通向消化道；神经节位于消化道前端的背侧。
蛹：幼虫期约4~5天（自孵化起计；自产卵起约5~6天）。化蛹前，3龄幼虫从培养基中爬出，附着在瓶壁上，逐渐收缩形成梭形的蛹。蛹起初颜色淡黄、体壁柔软，之后逐渐硬化并变为深褐色；体色变深表明即将羽化。
成虫：刚羽化的果蝇身体狭长，翅尚未完全展开，体色浅嫩，此时野生型与黑檀体的体色差别不明显。不久，虫体变为粗短的椭圆形，双翅展开，体色逐渐加深：野生型呈灰褐色，突变型黑檀体呈乌黑色。雌蝇羽化后约8~12 h达到性成熟并可交配，交配后约2天开始产卵。
1.2 温度与果蝇生命周期的关系
1.2.1 温度对果蝇生长速率的影响
温度是影响果蝇生长速率的关键因素。一般来说，在适宜温度范围内，果蝇的生长速率随温度升高而加快；当温度超过或低于某一临界值时，生长速率会受到明显抑制，甚至导致死亡。例如，25 ℃被认为是果蝇的最适生长温度，此温度下果蝇活力强；持续高于30 ℃的高温可导致果蝇不育甚至死亡；低于10 ℃时果蝇的生活力明显下降，发育近乎停滞。
1.2.2 温度对果蝇发育周期的影响
温度对果蝇的发育周期具有显著影响。实验观察表明，不同温度下果蝇的发育周期差异显著：温度越高，发育越快，发育周期越短；温度越低，发育越慢，发育周期越长。这一影响与温度对果蝇代谢速率、酶活性、激素水平及基因表达的调控密切相关。
1.2.3 温度对果蝇生活力和繁殖能力的影响
温度不仅影响果蝇的生长速率和发育周期，还对其生活力和繁殖能力有重要影响。在适宜温度条件下，果蝇生活力旺盛、繁殖能力强；温度过高或过低时，生活力受到抑制，繁殖能力下降。例如，在极端高温下，果蝇成虫可能陆续死亡；而在低温条件下，自然界中的果蝇不再活动，多聚集于果壳或烂果的孔穴中以维持生命。
1.2.4 不同温度下果蝇的具体表现
高温条件：当温度超过30 ℃时，果蝇的发育速率虽然加快，但高温可能导致体内水分散失过快、代谢紊乱等问题，进而引发死亡；此外，高温下发育的成虫体型偏小。
低温条件：低于10 ℃时，果蝇的生活力受到明显影响，正常生命活动减弱；气温低于8 ℃时，自然界中的果蝇成虫多聚集于果壳或烂果的孔穴里以抵御寒冷。
适宜温度：在25 ℃左右，果蝇生长速率适中、发育周期正常、生活力旺盛且繁殖能力强，是果蝇正常生长和繁殖的最佳温度条件。
2. 果蝇培养基和饲养条件
2.1 果蝇培养基
果蝇培养基通常包含多种成分，以提供果蝇生长繁殖所需的营养。常见配方成分如下：
2.1.1 基本成分
玉米粉、酵母粉（干酵母或活性酵母粉）、琼脂粉、蔗糖和葡萄糖等。其中，玉米粉主要提供碳水化合物，酵母粉提供蛋白质，琼脂粉为凝固剂，蔗糖和葡萄糖提供能量来源。此外还需添加防腐剂（山梨酸钾、尼克净）以抑制霉菌生长。
2.1.2 参考配方
表1 食物配方
| 食物总量（L） | 蔗糖（g） | 葡萄糖（g） | 无水氯化钙（g） | 琼脂（g） | 酵母（g） | 玉米面（g） |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 31.62 | 63.24 | 0.726 | 10.6 | 32.19 | 77.7 |
| 2 | 63.2 | 126.5 | 1.5 | 21.2 | 64.4 | 155.4 |
| 3 | 94.9 | 189.7 | 2.2 | 31.8 | 96.6 | 233.1 |
| 4 | 126.5 | 253.0 | 2.9 | 42.4 | 128.8 | 310.8 |
| 5 | 158.1 | 316.2 | 3.6 | 53.0 | 161.0 | 388.5 |
| 6 | 189.7 | 379.4 | 4.4 | 63.6 | 193.1 | 466.2 |
| 7 | 221.3 | 442.7 | 5.1 | 74.2 | 225.3 | 543.9 |
| 8 | 253.0 | 505.9 | 5.8 | 84.8 | 257.5 | 621.6 |
| 9 | 284.6 | 569.2 | 6.5 | 95.4 | 289.7 | 699.3 |
| 10 | 316.2 | 632.4 | 7.3 | 106.0 | 321.9 | 777.0 |
表2 添加剂配方
| 食物总量（L） | 山梨酸钾（g） | 尼克净（ml） |
|---|---|---|
| 1 | 2 | 15 |
| 2 | 4.0 | 30.0 |
| 3 | 6.0 | 45.0 |
| 4 | 8.0 | 60.0 |
| 5 | 10.0 | 75.0 |
| 6 | 12.0 | 90.0 |
| 7 | 14.0 | 105.0 |
| 8 | 16.0 | 120.0 |
| 9 | 18.0 | 135.0 |
| 10 | 20.0 | 150.0 |
尼克净配方：100 g 对羟基苯甲酸甲酯 + 1000 ml 95%酒精（质量体积比1:10）。
图2 培养基配方
2.1.3 配制步骤（以配制6 L培养基为例）
- 用大电热水壶烧开约3 L水，小电热水壶烧开约1 L水，备用。
- 按表1，用500 ml塑料烧杯分别称取蔗糖、葡萄糖、无水氯化钙，倒入同一个2 L玻璃烧杯中，加入1.8 L开水（此为配制6 L培养基的用量，实际可按配制量酌情增减）；用木筷搅拌至固体完全溶解后，倒入电饭锅中，按"煮饭"键加热。
- 在2 L玻璃烧杯中加入1 L开水；按表1称取琼脂粉，缓慢倒入2 L烧杯中，边倒边用塑料饭勺搅拌；混匀后，将烧杯中的液体全部倒入电饭锅中，用木饭勺搅拌1分钟。
- 在2 L玻璃烧杯中加入1 L开水；按表1称取酵母粉，缓慢倒入2 L烧杯中，边倒边用塑料饭勺搅拌；混匀后，将烧杯中的液体全部倒入电饭锅中，用木饭勺搅拌2分钟。
- 按表1，用白色长方形塑料盒称取玉米面；在2 L塑料烧杯中加入1.5 L常温自来水，慢慢倒入塑料盒中，边倒边用塑料饭勺搅拌，如有结块，用饭勺挤压碾细。
- 将混匀的玉米面糊缓慢倒入锅中，边倒边用木饭勺搅拌；塑料盒底部残留的玉米面，再用约500 ml常温自来水冲溶，一并倒入锅中。
- 补水：补加水量 = 培养基总体积 − 步骤2、3、4、5中所加水的总体积（例如：6 L − 1.8 L − 1 L − 1 L − 1.5 L = 0.7 L）。为补偿蒸发损失的水分，再额外补加总体积5%的水（例如6 L培养基需再补加 6 L × 5% = 300 ml）。
- 用木饭勺不停搅拌约10分钟。
- 按表2，在大玻璃管中称取一定量的山梨酸钾，加水溶解；再按表2用量筒量取一定量的尼克净溶液。待培养基煮沸（开锅）后，将山梨酸钾溶液和尼克净溶液倒入锅中，搅拌混匀，培养基配制完成。
2.2 饲养条件
果蝇的饲养条件需要严格控制，以确保其正常生长和繁殖：
- 温度：果蝇的适宜饲养温度为18~25 ℃，最适温度为25 ℃。在此范围内，果蝇的生长和繁殖速度适中，生活力较强。温度过高（超过30 ℃）可导致不育或死亡；温度过低（低于10 ℃）时生活力显著下降。
- 湿度：适宜的相对湿度约为60%~70%。保持适当的湿度有助于果蝇的正常生长和繁殖。
- 光照：果蝇对光照要求不高，建议按规律的昼夜节律照明（如12 h光照/12 h黑暗），既减少外界干扰，也便于掌握羽化时间（见第4节"处女蝇收取"）。
- 通风：饲养环境需保持良好通风，避免闷湿和霉菌滋生。
- 容器：果蝇通常使用玻璃指管或培养瓶饲养，配以棉塞或透气塞。容器应透明，便于观察果蝇的生长和繁殖情况；并需定期清洗和灭菌（如高压蒸汽灭菌或干热灭菌），防止细菌、霉菌和螨虫污染。
- 食物：除上述培养基外，也可根据实验需要补充其他食物来源，如新鲜水果或酵母菌液等。培养基应保持湿润，但避免水分过多积聚而导致发霉。
- 管理：为保持果蝇品系的纯度和健康状态，需定期更换培养基、清理容器，并做好螨虫等病虫害的防治；同时注意避免不同品系间的混杂（交叉污染）。
- 培养基更换：① 25 ℃条件下每两周更换一次培养基，最长保存18天——老化的培养基羽化出的果蝇少而弱，且容易滋生霉菌和螨虫；② 18 ℃条件下约3周更换一次培养基。
- 备份：果蝇只能以活体形式保存，因此每个品系最好都有备份。瓶养果蝇一般养两瓶（重要或娇贵品系应多养几瓶），各瓶传代可以同步，也可以相隔半代错开。
- 标记：给果蝇做标记同样重要。最简单的方法是用环形标签写明该品系的全部信息（果蝇名称、果蝇库编号等）；同时注明开始培养的日期，以便确定果蝇的日龄。
- 清洁：定期使用消毒剂（如70%酒精）对饲养容器和工具进行消毒。
- 螨虫防治：果蝇饲养是一切以果蝇为模式生物的实验的基础。饲养过程中有一种微小的生物对其影响极大，处理不当可导致品系灭绝，那就是螨虫（图1.2）。螨虫一般以酵母为食，也会取食果蝇的胚胎和蛹，并能污染相邻的饲养瓶。新引入的品系应先隔离饲养观察，发现螨虫后及时用除螨剂处理或热处理清除；污染严重的饲养瓶应整瓶废弃，并从备份品系重新复苏。
图3 螨虫
3. 果蝇杂交与繁殖
3.1 杂交比例
果蝇杂交时，雌雄可按1:1配对（单对杂交）；为提高产卵量和后代数量，也常用2~3只处女蝇与1只雄蝇配对（父本仍然唯一，便于后代基因型追踪）。
3.2 杂交流程
- 选择亲本：选择用于杂交的雌雄果蝇。雌蝇应为健康的成熟处女蝇（收取方法见第4节），雄蝇应为健康、性成熟的成虫。
- 交配：将选定的雌雄果蝇放入杂交瓶中。雌蝇通常在羽化后2~5天内即可交配。
- 交配时长：果蝇的交配过程本身较快，通常约10~20分钟完成；为确保交配成功，一般将雌雄果蝇同瓶过夜（约12~24 h）。
- 产卵：交配后，雌蝇约2天开始产卵，并在随后数天内持续产卵。
- 孵化：25 ℃下，卵约1天（24 h）孵化为幼虫。
- 幼虫期：幼虫期持续约4~5天，期间经历两次蜕皮、三个龄期。
- 化蛹：3龄幼虫最后一次蜕皮前离开培养基，附着于瓶壁化蛹；自产卵起约5~6天。
- 成虫羽化：蛹期约4~5天，自产卵起约9~10天羽化为成虫（图3.1）。
图4 幼虫期-蛹的发育阶段
整个杂交周期，从交配到新一代成虫羽化，25 ℃下约需10~14天（图3.1）。如果需要连续杂交多代或有其他特殊要求，所需时间会更长。进行杂交实验时，应仔细记录每个步骤的时间点，以确保实验的准确性和可重复性；同时，实验条件（温度、湿度、食物等）也会影响果蝇的发育速度，需严格控制。
- 后代数量：在25 ℃条件下，果蝇约10天可繁殖一代，一只雌蝇一生可产数百枚卵，后代数量可达数百只。成虫自羽化后约8 h即可交配，交配后约2天开始产卵。
交配特点：果蝇的交配行为有较显著的特点。雄蝇一生中可交配多次；而雌蝇一次交配后，其储精囊内储存的精子可维持一生产卵的需要，理论上无需再次交配。但实际上，雌蝇在生命周期中也可能发生再交配，尤其是在实验室条件下或自然环境中，当储精不足或需要增加遗传多样性时。一次成功的交配后，雌蝇储存的精子通常足以支持其产生数百甚至上千个后代。
需要注意的是，果蝇的交配行为和交配次数还受环境条件、遗传背景、种群密度等多种因素影响。在实验室研究中，可以通过控制这些因素来研究果蝇的特定行为或生物学过程。
生殖力：雄蝇羽化后很快达到性成熟；雌蝇性成熟较雄蝇晚，一般在羽化后8~12 h，不同品系之间有所差异。25 ℃条件下，果蝇寿命一般为40~50天，个别可活到80天。杂交宜使用羽化10天以内的成虫，日龄越大生殖力越低。
4. 处女蝇收取
4.1 处女蝇鉴定方法
4.1.1 时间控制法
- 羽化时间：在25 ℃左右饲养时，果蝇羽化（成虫从蛹中出来）后的一段时间内（通常为8 h以内）雌蝇尚未性成熟，不会交配，可视为处女蝇。
- 收集时间：将培养瓶中的全部成虫倒净，之后每隔一定时间（25 ℃不超过8 h，18 ℃不超过16 h）收集新羽化的成虫，该时间段内羽化的雌蝇即为处女蝇。
4.1.2 外观特征法
- 体型与体色：新羽化的雌蝇体色浅、腹部半透明，体型与同龄雄蝇相比稍大，腹部末端较尖。但这一特征并非绝对可靠，因为随着果蝇日龄增长和交配状态变化，体型和体色都会发生变化。
- 腹部胎便斑：刚羽化的果蝇，透过腹部体壁可见一个深色小斑，这是孵化时残留的胎便（meconium）。胎便斑可作为新羽化（即处女）果蝇的标志，但需注意：胎便斑在羽化后数小时内即排出消失，且并非所有个体都明显可见。
4.1.3 显微观察法
在体式显微镜下对所要收集的果蝇进行详细甄选，通过观察外生殖器结构进一步确认其性别和发育状态（图4.1）。这种方法结果最可靠，但需要较高的专业知识和操作技能。
4.1.4 实验验证法
在某些情况下，为确保雌蝇的处女状态，可将收集到的雌蝇单独饲养2~3天，观察是否有幼虫产生。未交配的雌蝇虽可产卵，但卵不能孵化；若无幼虫出现，即可确认这些雌蝇为处女蝇。此法较为繁琐且耗时，通常只在需要高度确认处女状态时使用。
图5 处女蝇形态鉴定特点（左：雄蝇，具性梳；中：成熟雌蝇；右：处女蝇，腹部可见胎便斑）
图6 处女蝇腹部胎便斑
4.2 处女蝇收取条件
温度循环：通过温度循环可以最大限度地增加一个早晨收集到的处女蝇数量。当培养物保持在18 ℃时，发育减缓，雌蝇在羽化后约16 h才达到性成熟。因此，在下午/傍晚清除瓶内全部成虫并将培养瓶置于18 ℃，第二天早上收集到的新羽化果蝇约98%为处女蝇；将收集的雌蝇单独饲养2~3天，即可剔除约2%的非处女蝇（有幼虫出现者弃用）。
杂交所需的雄蝇可随时收集。值得注意的是，3日龄左右的雄蝇与处女蝇交配效率最高；日龄过大（大于10~15天）的雄蝇交配能力显著下降。这是因为雄蝇羽化后需要经历一个性成熟过程才能与雌蝇有效交配。
4.3 处女蝇收取方法
- 时间法（清除—收集法）：在25 ℃条件下，新羽化8 h内的雌蝇不会与雄蝇交配。因此，通过"早晨清除、7~8 h后收集"两个步骤即可方便地获得处女蝇。在规律昼夜照明下，早晨是大多数蛹羽化的高峰时段。收集前7~8 h（一般为当天早上第一件事）清除瓶内全部成虫，并仔细检查培养基表面和瓶壁，确保无成虫残留；7~8 h后收集全部雌蝇，即为处女蝇。将收集的处女蝇转入新鲜培养瓶中饲养2~3天，检查有无幼虫：未交配的雌蝇可以产卵，但卵不育（不孵化）；若出现幼虫，则说明混入了非处女蝇，应弃用。
- 表型法（视觉方法）：新羽化的雌蝇体色浅（苍白）、腹部半透明，与日龄较大的雌蝇明显不同；此外，在羽化后的最初几小时，腹部可见深色的胎便斑。
4.4 处女蝇收取时间
4.4.1 常规使用
常规使用是指工具果蝇不加急、不增量，供常规杂交使用。
饲养条件：全程18 ℃。
| 批次 | 收取时间 | 收取方式 |
|---|---|---|
| 第一批 | 早上8:00 | 表型法收取（体色较浅，腹部有黑灰色小斑块） |
| 第二批 | 晚上16:00 | 时间法收取（保证全程18 ℃饲养，距上次清除不超过16 h，所有雌蝇均为处女蝇） |
4.4.2 加急、加量使用
加急、加量是指需要在短期内加急、加量收取处女蝇（一般项目处女蝇越快越好）。
饲养条件：晚上18 ℃，白天25 ℃或28 ℃。
| 批次 | 收取时间 | 收取方式 |
|---|---|---|
| 第一批 | 早上8:00 | 表型法收取（体色较浅，腹部有黑灰色小斑块） |
| 第二批 | 中午12:00~13:00 | 时间法收取（25 ℃不超过5 h；28 ℃不超过3 h） |
| 第三批 | 晚上17:00 | 时间法收取（25 ℃不超过5 h；28 ℃不超过3 h） |
4.5 特别注意
- 收取处女蝇时，应保证每次将瓶中成虫清理干净；若瓶内有成虫残留（粘在培养基表面），可用镊子夹出，确保瓶内无成虫残留。
- 收取时应即收即取，逐瓶从温箱中取出收取，完成后再取下一个品系，尽可能保证收取温度与饲养温度一致。
- 若收取时果蝇数量较多（如w1118），可分成两批收取，避免一次麻醉时间过长，影响后续杂交效率。
- 分虫时雌雄一定要分清，雌蝇管中不要混入雄蝇；若后续使用时发现处女蝇管中有雄蝇，该管处女蝇应弃用。
