CRISPR Indel 移码突变
单 gRNA 引导 Cas9 切割基因组靶位点，由 NHEJ 修复引入小片段插入缺失，造成编码区移码突变从而破坏基因功能。
原理 · 流程 · 优势 · 适用 · 风险
技术原理
Cas9 核酸内切酶在 gRNA 引导下识别并切割基因组靶位点，产生 DNA 双链断裂。细胞通过非同源末端连接（NHEJ）修复该断裂时，可在断裂位点引入小片段插入或缺失（Indel）。当 Indel 长度非 3 的倍数时，导致下游编码区移码突变，使蛋白翻译提前终止或产生截短蛋白，从而破坏目标基因功能。
工作流程
项目评估与方案设计
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Target 测序
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注射样品制备
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显微注射
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杂交鉴定
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稳定系/纯合系构建
核心优势
- 操作成熟、周期短：标准化单 gRNA 设计流程，平均交付周期 13~15 周
- 设计简单：单 gRNA 即可引导 Cas9，适用于大多数蛋白编码基因
- 递送方式灵活：支持胚胎注射、细胞转染等多种递送路径，适配不同实验设计
- 多等位基因筛选：可针对同一基因设计多个 gRNA，便于筛选不同移码等位基因进行表型比较
典型适用
风险与限制
- Indel 结果具有不确定性：可能获得移码、框内缺失、插入或复杂等位基因，必须通过测序筛选，不能仅凭编辑阳性判断敲除成功
- 可能存在残余基因功能：移码后仍可能发生异常剪接、替代翻译或残余蛋白表达。重要项目建议结合 RNA、蛋白或遗传回补实验验证
- 脱靶和非预期在靶改变：建议在项目设计阶段评估潜在脱靶位点，必要时通过全基因组测序或脱靶位点深度测序验证
技术原理
两大核心要素
- Cas9 核酸内切酶：在 gRNA 引导下识别基因组 PAM 上游序列，在特定位点产生 DNA 双链断裂（DSB）。
- gRNA 引导序列：约 20 nt 的特异性序列决定靶位点识别，结合 Cas9 后介导精准切割。
细胞主要通过 NHEJ 修复 DSB，在修复过程中引入小片段插入或缺失；当 Indel 长度非 3 的倍数时，可造成编码区移码突变，使蛋白翻译提前终止或产生截短蛋白，从而破坏目标基因功能。
实验流程
