CRISPR KI (Replacement) 基因替换
通过 HR 修复将内源基因替换为外源同源基因；特别适合内源序列与替换序列相似度较低的情况。
原理 · 流程 · 优势 · 适用 · 风险
技术原理
设计 gRNA 靶向目标内源基因编码区，构建含长同源臂（5' / 3' HA 各 1-2 kb）+ 外源同源基因序列（如人类、小鼠、斑马鱼等物种的同源基因）的 donor 质粒。Cas9 切割后细胞通过 HR 修复，将内源基因整段替换为外源插入序列。该方案特别适合内源序列与替换序列相似度较低的情况，避免同源臂识别冲突。
工作流程
项目评估与方案设计
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Target 测序
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注射样品制备
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显微注射
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杂交鉴定
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稳定系/纯合系构建
核心优势
- 整段基因替换：可一次性替换内源基因整段编码区，避免 KI-tag 的标签融合局限
- 跨物种同源基因替换：支持人、小鼠、斑马鱼等物种的同源基因外源片段替换内源基因
- 长同源臂保证 HR 效率：5'/3' HA 各 1-2 kb 的长同源臂显著提升同源重组成功率
- 不受序列相似度限制：特别适合内源与替换序列相似度低、不易使用常规 KI-tag 的场景
典型适用
风险与限制
- HR 效率较低：基因替换依赖 HR 而非 NHEJ，整体敲入效率显著低于 KI-tag，需要更多胚胎注射量和精细筛选
- 长同源臂构建复杂：5'/3' HA 各 1-2 kb 的 donor 质粒构建周期较长（3-4 周），对克隆和测序验证要求高
- 替换边界不精确：HR 边界处可能出现小片段插入/缺失或残留序列，需 Sanger 测序确认断点
- 内源调控丢失：整段替换后可能丢失原基因的远端调控元件或非翻译区，需评估对表达水平的影响
技术原理
长同源臂 donor + HR 介导
针对目标内源基因编码区设计 gRNA，构建含 5'/3' 长同源臂（各 1-2 kb）+ 外源同源基因序列的 donor 质粒，通过 HR 介导的精准替换实现内源基因整段置换。
该方案特别适合内源序列与替换序列相似度较低、常规 KI-tag 难以实施的场景；通过长同源臂保证 HR 效率，避免同源臂识别冲突。
实验流程
有筛选标记方案（含 marker 去除步骤）
无筛选标记方案
