CRISPR KI (Tag) 标签插入
通过 CRISPR 和 donor 质粒的同源重组修复，在目标基因内源位点精准插入 GFP / FLAG / HA / Myc / V5 等标签或其它外源基因序列；支持"有筛选标记"和"直接无筛选标记"两种技术方案。
原理 · 流程 · 方案 · 优势 · 适用 · 风险
技术原理
通过 CRISPR 和 donor 质粒（同源臂 + 插入序列）的共同作用，实现对靶点进行切割的同时，由细胞 HR（同源重组）修复方式在目标基因内源位点精准插入 GFP、FLAG、HA、Myc、V5 等标签或其它外源基因序列。本服务支持"有筛选标记"和"直接无筛选标记"两种技术方案：前者使用 RFP 等标记便于阳性筛选但需后续移除，后者通过分子鉴定获得精确无多余序列的插入。
工作流程
项目评估与方案设计
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Target 测序
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注射样品制备
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显微注射
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杂交鉴定
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marker 去除与复核（按需）
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稳定系/纯合系构建
技术方案对比
| 项目 | 无 marker | 有 marker |
|---|---|---|
| 获得阳性方式 | 分子鉴定 | 表型筛选（RFP） |
| 效率 | 略高 | 略低 |
| 筛选阳性通量 | 大部分 F1 代 | 全部 F1 代 |
| 成功率 | 较高 | 较高 |
| 编辑后序列 | 精确 无多余序列 | 移除后残留 34bp 的 loxP |
| 周期 | 相对短 | 较长，需要 marker 移除 |
| 价格 | 相对高，分子鉴定成本高 | 相对低，阳性筛选方便 |
| 试用范围 | 广泛 | 仅针对 C 端插入 |
核心优势
- 精准插入：通过 HR 同源重组将标签精确插入目标基因内源位点，保留天然表达调控
- 多标签兼容：支持 GFP / FLAG / HA / Myc / V5 等常用标签，适配不同检测需求
- 双方案可选：提供有 marker 与无 marker 两套方案，平衡筛选便利性与最终序列精度
- 适用性广：可用于蛋白定位、互作、表达追踪等多种功能研究场景
典型适用
风险与限制
- 标签功能干扰：Tag 或 linker 可能影响蛋白折叠、稳定性、定位、酶活性或蛋白互作。N/C 端选择需结合功能域、信号肽和末端基序评估；已有研究报道某些 C 端标签可造成果蝇蛋白功能缺失
- marker 残留影响：筛选标记及去除后残留的重组位点可能干扰邻近基因表达、RNA 加工或后续遗传操作
- 表达检测限制：内源低表达蛋白即使正确插入荧光 Tag，也可能因信号较弱而难以直接成像
- 品系构建风险：对必需基因进行标签插入后，若纯合个体不存活或不育，可能只能建立杂合或平衡品系
技术原理
通过 CRISPR 在目标基因特定位点产生双链断裂，配合携带同源臂和插入序列的 donor 质粒，由细胞 HR 修复机制实现标签的精准插入。下方分别展示有筛选标记和无筛选标记两种方案的工作原理。
有筛选标记方案
无筛选标记方案
实验流程
有筛选标记方案（含 marker 去除步骤）
无筛选标记方案
