CRISPR Point Mutation 点突变
通过同义突变 donor 在目标氨基酸两侧引入标记，HR 修复精准实现氨基酸位点替换。
原理 · 流程 · 优势 · 适用 · 风险
技术原理
根据目标转录本和突变位点，设计邻近且脱靶风险较低的 gRNA。Cas9 在目标区域产生 DNA 双链断裂，细胞以含目标突变和同源臂的 donor DNA 为模板，通过同源定向修复（HDR）将指定序列写入基因组。若目标突变本身不能阻止 Cas9 再次识别，可在 PAM 或 gRNA seed 区加入最少量、经评估的同义阻断突变，以降低修复后再次切割的风险，并辅助分子筛选。
工作流程
项目评估与方案设计
→
Target 测序
→
注射样品制备
→
显微注射
→
杂交鉴定
→
稳定系/纯合系构建
核心优势
- 单氨基酸精准替换：可定向改变单个氨基酸残基，不影响上下游序列与蛋白整体结构
- 原版背景保真：仅替换目标位点，保留基因天然调控元件与表达模式，避免整段删除或标签融合的副作用
- 灵活设计阻断突变：可在 PAM 或 gRNA seed 区加入最少量同义阻断突变，显著降低修复后再次切割风险
- 分子筛选便利：同义阻断突变天然引入限制性酶切位点或 PCR 标识，便于筛选与建系鉴定
典型适用
风险与限制
- HDR 效率较低：单氨基酸替换依赖 HR 而非 NHEJ，整体敲入效率显著低于 Indel/KO，需要更多胚胎注射量和精细筛选
- 同义阻断突变引入风险：在 PAM 或 gRNA seed 区加入的同义阻断突变虽不改变氨基酸，仍需评估对 mRNA 折叠、剪接或翻译效率的潜在影响
- 候选位点受限：需在 gRNA 切割位点附近存在合适的同义突变空间，且目标氨基酸位于 PAM 上下游合理距离内
- 验证依赖 Sanger 测序：点突变改造需通过 Sanger 测序确认替换边界和同义突变引入准确性，周期与成本较 Indel 更高
技术原理
HDR 介导的精准氨基酸替换
针对目标氨基酸位点设计 gRNA 并构建含同义突变 + 同源臂的 donor DNA，通过 HDR 将目标氨基酸位点精准替换为目标残基，同时通过同义突变在两侧引入辅助筛选标记。
若目标突变本身不能阻止 Cas9 再次识别，可在 PAM 或 gRNA seed 区加入最少量、经评估的同义阻断突变，以降低修复后再次切割的风险，并辅助分子筛选与建系。
实验流程
