qPCR 基因表达检测

总 RNA 提取 · 反转录 cDNA · 实时荧光定量 PCR · 输出表达量 / 差异倍数 / 统计学显著性

原理 · 流程 · 优势 · 适用

技术原理

从生物样品中提取总 RNA 并反转录为 cDNA，加入目标基因特异性引物与荧光染料（SYBR Green）或荧光探针（TaqMan）在实时 PCR 仪上进行扩增。每经过一个循环采集荧光信号，得到 Ct 值（达到阈值所需循环数），用 ΔΔCt 法计算目标基因相对内参基因（如 GAPDH、β-actin、RP49）的表达差异。

工作流程

RNA 提取 → 反转录 → qPCR 上机 → 数据分析

核心优势

高灵敏度（可检测低拷贝数转录本）
高特异性（引物 / 探针双重识别）
可绝对定量（标准曲线法）或相对定量（ΔΔCt 法）
熔解曲线验证扩增特异性

典型适用

基因表达定量差异表达分析时空表达谱通路验证 RNAi 敲降效率转基因表达水平

实时荧光定量 PCR 原理

qPCR 基因表达检测标准流程

实验步骤	内容	周期(周)
总 RNA 提取	样品类型沟通（细胞 / 组织 / 果蝇个体等）与样品预处理 TRIzol 法或柱式法提取总 RNA DNase I 处理去除基因组 DNA 污染 RNA 浓度 / 纯度检测（Nanodrop A260/A280 比值）琼脂糖凝胶电泳验证 28S / 18S 完整性	0.5~1
反转录 cDNA	反转录引物选择（Oligo dT / Random hexamer / 特异性引物） MMLV 逆转录酶反应（25°C 退火 → 42°C 延伸 → 85°C 灭活） cDNA 产物质检（可选） cDNA 稀释备用（−20°C 保存）	0.5~1
qPCR 上机定量	目标基因特异性引物设计与验证（特异性 / 扩增效率 95-105%）反应体系配制（SYBR Green 预混液 + 引物 + cDNA） 96 孔板 / 384 孔板上机（3 技术重复 + 内参 + NTC）扩增程序：95°C 预变性 → 40 个循环（95°C 变性 → 60°C 退火延伸）→ 熔解曲线	1
上机分析与结果报告	Ct 值采集与质量控制（重复性、熔解曲线单峰） ΔΔCt 法计算相对表达量（含内参校正）统计学分析（t 检验 / ANOVA / 多重比较）输出：扩增曲线图 / 熔解曲线图 / 柱状图 + 显著性标记 / 原始 Ct 值表交付完整实验报告（含方法、结果、结论、原始数据）	1~2
合计	—	3~5