Western Blot 蛋白印迹分析

蛋白提取 · BCA 定量 · SDS-PAGE · 转膜 · 一抗二抗孵育 · 化学发光显影 · 蛋白层面验证

原理 · 流程 · 优势 · 适用

技术原理

从生物样品中提取总蛋白并用 BCA 法测定浓度，等量蛋白经 SDS-PAGE 按分子量分离后通过电转移至 PVDF / NC 膜上，经脱脂奶或 BSA 封闭非特异性位点，依次孵育目标蛋白特异性一抗与酶标二抗（HRP），最后通过 ECL 化学发光或显色底物在成像系统中获得目的条带。以内参蛋白（如 GAPDH、β-actin、Tubulin）作为上样量对照。

工作流程

蛋白提取 → BCA 定量 → SDS-PAGE → 转膜 → 抗体孵育 → 显影成像

核心优势

从蛋白层面验证基因表达
可半定量（结合内参灰度分析）
检测翻译后修饰（磷酸化 / 糖基化 / 乙酰化等）
抗体特异性高，结果可信

典型适用

蛋白表达检测磷酸化 / 修饰分析蛋白互作（Co-IP 后）抗体特异性验证转基因株系验证信号通路分析

Western Blot 三步流程示意

Western Blot 标准流程

实验步骤	内容	周期(周)
蛋白提取	样品裂解（RIPA / SDS 裂解液 + 蛋白酶抑制剂 cocktail）超声破碎或匀浆离心取上清（4°C · 12000 rpm · 15 min） −80°C 保存备用	0.5
BCA 蛋白定量	BCA 工作液配制（A 液 + B 液 = 50:1）标准曲线（BSA 系列稀释 0-2000 μg/mL）样品与工作液 37°C 孵育 30 min 酶标仪读取 A562 · 计算浓度调整上样量一致（加 loading buffer + 煮沸 5 min 变性）	0.2
SDS-PAGE 电泳	制胶（浓缩胶 5% + 分离胶 8-12%，按目标蛋白分子量选择）上样（每孔 20-50 μg 总蛋白，含 marker）电泳：80 V 浓缩 → 120 V 分离（溴酚蓝到底）	0.3
转膜	PVDF 膜甲醇活化 30 s 湿转 / 半干转（300 mA · 60-90 min · 冰浴）丽春红染色验证转膜效率（可选）	0.2
封闭	5% 脱脂奶 / BSA（TBST 配制）室温封闭 1-2 h（或 4°C 过夜）	0.1
一抗孵育	按说明书稀释一抗（1:500-1:5000） 4°C 摇床孵育过夜（12-16 h） TBST 洗膜 3 × 10 min	0.3
二抗孵育	HRP 标记二抗（1:5000-1:10000）室温孵育 1-2 h TBST 洗膜 3 × 10 min	0.1
显影与结果分析	ECL 化学发光底物（A + B 液 1:1 混合）化学发光成像系统采集图像（自动 / 手动曝光） ImageJ 灰度分析：目标条带 / 内参条带 = 相对表达量交付原始条带图 + 量化柱状图 + 实验报告	0.2
合计	—	2~3